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谷晓丽 喻丽 陈朋杰 杨蕊 杨秀鹏 许勇钢 中国中医科学院西苑医院血液科，北京100091摘 要目的探讨青黄散灌胃对骨髓增生异常综合征（MDS）小鼠骨髓细胞凋亡、周期的影响及

 

谷晓丽  喻丽 陈朋杰 杨蕊 杨秀鹏 许勇钢 中国中医科学院西苑医院血液科，北京100091摘 要目的探讨青黄散灌胃对骨髓增生异常综合征（MDS）小鼠骨髓细胞凋亡、周期的影响及机制方法用Tg（Vav1-NUP98/HOX D13）G2Apla/J转基因MDS小鼠模型进行取精扩繁，将40只模型小鼠随机分为模型组和青黄散低、中、高剂量组及阿扎胞苷组，每组8只，取8只C57BL/6J小鼠作为空白组。

空白组、模型组给予生理盐水100 μL灌胃，均每天1次；青黄散低、中、高剂量组分别给予青黄散36.4、72.8、145.6 mg/kg灌胃，均每天1次；阿扎胞苷组给予1 mg/kg阿扎胞苷注射液100 μL于颈部皮下注射，3天1次。

干预4周，处死小鼠，采集外周血，并提取骨髓细胞检测各组血常规［白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）］，用流式细胞术检测骨髓细胞凋亡率、周期，用荧光定量PCR法检测骨髓细胞内DNA-甲基转移酶1（DNMT-1）、受体酪氨酸激酶（c-KIT）、GATA结合蛋白1（GATA-1）mRNA，用Western blotting法检测骨髓细胞内DNMT-1、c-KIT、GATA-1蛋白。

结果与空白组比较，模型组WBC、RBC、HGB、PLT低（P均<0.05），说明建模成功；与模型组比较，青黄散低、中剂量组及阿扎胞苷组WBC、RBC、HGB、PLT高（P均<0.05）；青黄散低、中、高剂量组及阿扎胞苷组WBC、RBC、HGB、PLT比较差异无统计学意义（

P均>0.05）与空白组比较，模型组骨髓细胞凋亡率低（P<0.05）；与模型组比较，青黄散低、中、高剂量组及阿扎胞苷组骨髓细胞凋亡率高（P均<0.05）与空白组比较，模型组骨髓细胞周期变化差异有统计学意义（。

P均<0.05）；与模型组比较，青黄散低、中、高剂量组及阿扎胞苷组S期骨髓细胞少，G1期骨髓细胞多（P均<0.05）与空白组比较，模型组DNMT-1、c-KIT、GATA-1 mRNA表达低（P均<0.05）；与模型组比较，青黄散低、中、高剂量组及阿扎胞苷组DNMT-1、GATA-1 mRNA表达低（。

P均<0.05），青黄散低、中剂量组c-KIT mRNA表达高（P均<0.05）与空白组比较，模型组DNMT-1、c-KIT、GATA-1蛋白表达低（P均<0.05）；与模型组比较，青黄散低、中、高剂量组及阿扎胞苷组c-KIT蛋白表达低（。

P均<0.05），GATA-1蛋白表达高（P均<0.05），青黄散低、中、高剂量组DNMT-1蛋白表达低（P均<0.05）结论青黄散灌胃可促进MDS小鼠骨髓细胞凋亡，阻滞其细胞周期，其作用机制可能与调控DNMT-1、c-KIT、GATA-1表达有关。

关键词骨髓增生异常综合征；青黄散；骨髓细胞凋亡；骨髓细胞周期；DNA-甲基转移酶1；受体酪氨酸激酶；GATA家族转录因子骨髓增生异常综合征（MDS）是一组以骨髓造血干/祖细胞发育异常、外周血细胞异常以及向急性髓细胞性白血病转变风险的恶性克隆性疾病

［1］目前MDS的发病机制尚不明确，可能与分子遗传、造血微环境改变、造血干/祖细胞增殖和凋亡紊乱等有关，现国内外唯一可能使其治愈的方法是造血干细胞移植，但多数患者发病时年事已高，不宜进行造血干细胞移植，且骨髓供体少。

青黄散是中国中医科学院西苑医院血液科治疗MDS的验方，由青黛和雄黄组成，具有凉血解毒化瘀的功效，可提高患者生活质量，但青黄散治疗MDS的作用机制尚未完全清楚目前Tg（Vav1-NUP98/HOX D13）G2Apla/J（NHD13）转基因小鼠是模拟MDS最准确的小鼠模型。

［2］，NHD13小鼠表现出贫血、中性粒细胞减少和淋巴细胞减少，表明造血无效［3］该模型也可用于研究MDS进展为白血病［4］MDS小鼠为Tg（Vav1-NUP98/HOX D13）G2Apla/J的转基因小鼠，表达融合基因，此基因型在造血组织中特异性表达，易发生MDS症状，外周血血细胞减少、骨髓异型增生、易向急性髓系白血病转化。

为了保证实验的可靠性和准确性，2023年6月—2024年4月，本研究将MDS小鼠受精卵移植到C57BL/6J小鼠体内，进行批量繁育，将繁育的小鼠进行转基因鉴定，将转基因小鼠用于实验探讨青黄散对MDS小鼠骨髓细胞凋亡、周期的影响及机制。

1 材料与方法1.1　实验材料1.1.1　实验动物NHD13小鼠本体购于美国杰克逊实验室NHD13雄鼠2只，12周龄，各32.5 g、34.2 gC57BL/6J受体鼠30只，购于集萃药康生物科技有限公司，雌性，8周龄，体质量（22.41 ± 1.01）g，动物许可证编号：SCXK（苏）2018-8008。

小鼠均在北京科学技术研究院分析测试研究所SPF级环境下饲养，普通饲料、纯水，温度18～22 ℃，相对湿度50%～60%，每天10～14 h光照，适应性饲养1周本研究经中国中医科学院西苑医院伦理委员会批准（2022XLC065）。

1.1.2　实验试剂青黄散（中国中医科学院西苑医院药剂室），阿扎胞苷（荷兰Vidaza公司，H20170238），DNA-甲基转移酶1（DNMT-1，英国Abcam公司，ab188453），GATA结合蛋白1（GATA-1，英国abcam公司，ab133274），受体酪氨酸激酶（c-KIT，英国abcam公司，ab32363），β-Actin（美国Cell Singaling Technology公司，3700）；PVDF膜（美国MILLIPORE公司），异丙醇（北京化工厂），SYBR Mixture（美国Sigma公司，Cat#1725121）、凋亡检测试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司，CA1040），细胞周期检测试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司，CA1510-50T）。

1.1.3　实验仪器实时荧光定量PCR仪、生物分子成像仪（LAS-4000 MINI）、低温高速离心机（德国EPPENDORF公司），微量分光光度计［中国赛默飞世尔科技（中国）有限公司］，显微镜（德国Carl Zeiss公司）。

1.2　NHD13模型小鼠繁育及分组30只C57BL/6J受体鼠和2只雄鼠用于培育扩繁NHD13模型鼠，共培育NHD13模型鼠52只，随机抽取40只模型鼠分为模型组、青黄散低、中、高剂量组及阿扎胞苷组，每组8只，空白组取8只C57BL/6J小鼠。

1.3　药物干预参考徐叔云主编的《药理实验方法学》，根据成人临床药物用量，按照小鼠的等效剂量折算系数，换算小鼠给药量0.036 4 g/（kg·d），将该剂量作为最小剂量，中剂量为0.072 8 g/（kg·d），高剂量为0.145 6 g/（kg·d）。

空白组、模型组给予生理盐水100 μL灌胃，均每天1次；青黄散低、中、高剂量组分别给予青黄散36.4、72.8、145.6 mg/kg（分别混悬于100 μL生理盐水）灌胃，均每天1次；阿扎胞苷组给予1 mg/kg阿扎胞苷注射液100 μL于颈部皮下注射，3天1次。

均干预4周1.4　骨髓细胞提取将各组小鼠置于充满CO2箱中10 min，使小鼠呼吸困难，将其颈椎脱臼处死在无菌的超净台中用手术剪将小鼠的胫骨和股骨剪下，置于冰上用PBS缓冲液冲出骨髓，将冲洗液置于15 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min，有效离心半径为15 cm，弃上清液，用PBS洗涤细胞2次，分装备检。

1.5　外周血细胞计数将小鼠处死后摘除其眼球取血，置于EDTA抗凝管中，用血球仪进行血细胞计数，包括白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）1.6　骨髓细胞凋亡检测采用流式细胞术。

取3×106/mL骨髓，1 000 r/min离心5 min，离心半径为15 cm，轻轻吸除上清液，留50 µL培养液加入1 mL 4 ℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心，轻轻吸除上清液将去离子水和Binding Buffer按1∶9稀释，制成浓度为原始浓度1倍的结合缓冲液；用结合缓冲液重新悬浮细胞，调节细胞为（1~5）×10。

6/mL；在每个流式管中滴入100 µL细胞悬液，加入5 µL Annexin V/FITC混匀，室温避光孵育5 min；每个流式管加入5 µL的碘化丙锭溶液，加入400 µL PBS，用流式细胞仪进行检测，计算细胞凋亡率。

1.7　骨髓细胞周期检测采用流式细胞术取3×106/mL骨髓，用PBS洗涤，1 500 r/min离心5 min，有效离心半径为15 cm，制成1×106/mL的细胞悬液1 500 r/min离心5 min，有效离心半径为15 cm，吸除上清液；加入500 μL 70%预冷的乙醇固定2 h，4 ℃冰箱过夜；用PBS洗去固定液，若有骨髓残渣，可使用200目细胞筛网过滤1次。

在细胞沉淀中加100 µL RNase A溶液，重悬细胞，在37 ℃水浴锅中放置30 min再加入400 µL PI染色液混匀，4 ℃避光孵育30 min，将混匀的细胞悬液放入流式细胞仪进行检测根据细胞周期检测试剂盒说明书将激发波长调为488 nm处红色荧光。

用Modfit软件分析结果，计算各周期骨髓细胞比例1.8　骨髓细胞内DNMT-1、c-KIT、GATA-1 mRNA检测采用荧光定量PCR法用酚-氯仿提取法提取骨髓细胞RNA，用微量分光光度计测定RNA浓度，RNA溶液保存在-80 ℃冰箱中备用。

RNA反转录体系总体积10 μL，该反应体系中RNA加入量为1 000 ng用软件设计荧光定量PCR引物，β-actin作为内参，上游引物序列5-CAGGCATTGCTGACAGGATG-3，下游引物序列5-TGCTGATCCACATCTGCTGG-3；c-KIT上游引物序列序列5-GCCTGACGTGCATTGATCC-3，下游引物序列5-AGTGGCCTCGGCTTTTTCC-3；DNMT-1上游引物序列5-AGGCGGAAATCAAAGGAGGA-3，下游引物序列5-GTTTGGCAGCTGGATCTCTG-3；GATA-1上游引物序列5-AAGACCAGGAAGGGAAGAGC-3，下游引物序列5-GTCAGGAGGTCTGGACTCAG-3。

反转录反应体系：2×UltraSYBR Mixture 5 μL、Forward Primer 0.3 μL、Reverse Primer 0.3 μL、Rnase-Free Water 2.4 μL、cDNA（稀释10倍）2 μL。

在ABI 7500 Fast以及7500荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃预退火/延伸30 s，共循环40次2-ΔΔCt法计算目标基因相对表达量1.9　骨髓细胞内DNMT-1、c-KIT、GATA-1蛋白检测

采用Western blotting法，将凝胶板放入垂直电泳槽，每孔蛋白样品上样量为20 μg，Marker加样量5 μL，进行SDS-PAGE电泳电泳结束后进行电转，将PVDF膜转移至极速高效封闭液封闭半小时，以1∶1 500稀释的鼠抗为一抗进行杂交，4 ℃冰箱过夜，洗膜，以1∶1 000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，室温振摇1 h，洗膜，显影。

显影结果使用Image J软件进行分析每条显影条带通过Image J软件测量灰度值，将目的蛋白的灰度值比内参蛋白灰度值作为目的蛋白的相对表达量1.10　统计学方法采用Graphpad Prism9.0统计软件。

符合正态分布的计量资料以

 ± s表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1　青黄散对小鼠外周血细胞计数的影响见表1。表1   各组外周血细胞计数比较（

 ± s）

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.052.2　青黄散对MDS小鼠骨髓细胞凋亡的影响空白组、模型组、青黄散低剂量组、中剂量组、高剂量组、阿扎胞苷组骨髓细胞凋亡率分别为（15.9 ± 1.66）%、（8.58 ± 0.52）%、（11.91 ± 1.75）%、（16.36 ± 1.61）%、（15.79 ± 1.86）%、（17.78 ± 2.30）%。

与空白组比较，模型组骨髓细胞凋亡率低（P<0.05）；与模型组比较，青黄散低、中、高剂量组及阿扎胞苷组骨髓细胞凋亡率高（P均<0.05）2.3　青黄散对MDS小鼠骨髓细胞周期的影响见表2表2   各组不同周期骨髓细胞分布比较（%，。

 ± s）

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.052.4　青黄散对MDS小鼠基因靶点DNMT-1、c-KIT、GATA-1 mRNA表达的影响见表3表3   各组骨髓细胞内DNMT-1、c-KIT、GATA-1 mRNA表达比较（。

 ± s）

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.052.5　青黄散对MDS小鼠基因靶点DNMT-1、c-KIT、GATA-1蛋白表达的影响见表4表4   各组骨髓细胞内DNMT-1、c-KIT、GATA-1蛋白表达比较（。

 ± s）

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.053 讨论研究发现，细胞出现凋亡及调控异常会导致MDS患者骨髓内造血细胞出现发育不良或无效造血，进而向白血病转化［6-9］实验研究表明，青黄散抑制MDS高危细胞系SKM-1、MUTZ-1的增殖，并诱导二者凋亡，从而诱导DNA、蛋白损伤。

［10］MDS发病早期造血细胞异常克隆和正常克隆并存，此时骨髓造血处于高增殖、高凋亡阶段，到晚期阶段造血细胞则出现异常克隆增殖，表现为高增殖、低凋亡［11］因细胞增殖和凋亡的动态平衡被打破，进而导致细胞分化异常，出现异常增殖，甚至抑制正常细胞克隆，从而形成肿瘤细胞。

临床上常通过诱导MDS恶性克隆细胞凋亡来恢复正常造血，但诱导细胞凋亡的药物种类少且疗效差，不良反应大青黄散治疗MDS疗效佳，且不良反应小本研究结果发现，与空白组比较，模型组HGB、RBC、PLT、WBC均低，说明模型鼠开始出现贫血、血小板减少等症状，建模成功；与模型组比较，青黄散低、中、高剂量组、阿扎胞苷组的HGB、RBC、PLT、WBC均高，说明治疗有效；与阿扎胞苷组比较，青黄散低、中剂量组HGB、RBC、PLT、WBC要优于阿扎胞苷组，青黄散高剂量组的HGB、RBC、PLT、WBC，基本与之持平，说明青黄散与阿扎胞苷的疗效相当，甚至优于阿扎胞苷，且并非青黄散的剂量越高效果越好，中剂量效果最佳。

研究表明，DNA甲基化异常是MDS、急性髓系白血病等恶性血液疾病的重要发病机制［12］DNMT-1和（或）DNA甲基转移酶3b的耗竭会介导肺癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤细胞的生长周期停滞，诱导其凋亡单个CpG二核苷酸的DNA甲基化会干扰GATA-1的结合和调节功能。

［13］c-KIT为Ⅲ型酪氨酸激酶受体家族中的重要成员，在造血细胞及内皮细胞中表达，c-KIT与其配体干细胞因子的相互作用在HSC的存活、有丝分裂、增殖、分化、黏附、归巢、迁移和功能激活中起关键作用［14

］研究发现，在红细胞成熟的过程中，c-KIT表达下调是必不可少的关键一环［15］GATA-1是红细胞生成的关键转录因子，GATA-1的缺失和过表达都会损害红细胞，这证明GATA-1稳态在红细胞生成过程中的重要性。

此外，有研究表明c-KIT与GATA-1存在负调节关系，c-KIT过表达的胎肝红细胞在分化条件下不能诱导GATA-1表达［16］本研究发现，与模型组比较，青黄散低、中、高剂量组及阿扎胞苷组S期骨髓细胞均少，G1期骨髓细胞增加，可见药物干预抑制了细胞周期由G1向S期转换。

与模型组比较，青黄散低、中剂量组及阿扎胞苷组均可下调c-KIT mRNA表达，青黄散低、中、高剂量组及阿扎胞苷组均可上调GATA-1 mRNA表达与模型组比较，青黄散低、中、高剂量组均可下调DNMT-1、c-KIT蛋白表达，上调GATA-1蛋白表达。

综上所述，青黄散可通过调控DNMT-1、GATA-1、c-KIT表达抑制MDS细胞周期转换，诱导细胞凋亡，从而发挥治疗MDS的作用虽然本实验的NHD13小鼠模型已完全可以模拟人类MDS，但为了更科学更严谨地证明青黄散对MDS的治疗作用，若能对此模型进行基因敲除再进行灌胃会更具有说服力，接下来我们将进行小鼠基因靶点敲除实验。

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